姚琦，高宁阳，慈元，李志君
（1.医院骨科，辽宁大连;2.上海中医院骨关节科，上海）
目的探讨中药独活对去卵巢所致骨质疏松SD大鼠的作用及其可能机制。方法将50只SD鼠，体重~g，随机分为假手术组、模型组、独活低剂量组（0.9g/kg）、独活高剂量组（1.8g/kg）、阳性药组（mg/kg依普*酮），每组10只。利用双侧卵巢切除法制备大鼠骨质疏松模型，手术模型制备成功后，连续灌胃给药60d。
测定股骨密度、骨灰重/干重百分比；测定大鼠血清骨钙素（OC）、骨碱性磷酸酶（ALP）、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）、血清钙、无机磷的水平。免疫组化法测定股骨中骨保护素（OPG）、破骨细胞分化因子（RANKL）蛋白表达；Westernblot法检测大鼠骨组织中β-catenin、p-β-catenin、GSK-3β、p-GSK-3β蛋白表达。结果独活高剂量和阳性药均能够增加大鼠股骨密度、骨灰重/干重，降低BGP、ALP及TRAP的水平，并增加血清钙的水平，对无机磷的表达无显著性影响,增加骨组织中OPG蛋白表达水平，降低RANKL蛋白表达水平,增加β-catenin、p-GSK-3β蛋白表达水平，降低p-β-catenin、GSK-3β蛋白表达。
结论独活高剂量（1.8mg/kg）对去卵巢导致的骨质疏松大鼠的治疗作用，与激活Wnt/β-catenin信号通路促进骨形成相关。
▲摘自《解剖科学进展》期刊年
第25卷第5期
独活；卵巢摘除；骨质疏松；骨形成；Wnt/β-catenin信号通路;SD大鼠
R.5
A
10./j.cnki.-..05.
骨质疏松症（osteoporosis，OP）是一种以全身骨量减少、骨组织微观结构退化为特征的一种疾病，骨质疏松患者骨密度降低而骨脆性增加，极易[1]发生骨折。骨质疏松分为原发性和继发性两大类，原发性骨质疏松多见于绝经后老年妇女，与卵巢功能减退、雌激素水平降低有关，严重影响着老年人[2]
的健康。
随着全球人口老龄化的加剧，骨质疏松症的发病率也逐年上升。目前临床上用于治疗骨质疏松的药物主要有钙剂、雌激素、维生素D、降钙素类
等化学药物，虽然效果不错，但是化学药物不良反应较多，不能长期服用。中医药治疗具有辨证论治、治疗效果佳、标本兼治、毒副作用小等优点，已经逐渐被广大患者所认可，因此，利用中医药理论寻找治疗骨质疏松症的药物具有非常重要的意义[3,4]。
中医学认为，肾主骨主髓，骨的生长退化与肾密切相关。现代医学也表明，肾虚是骨质疏松症的基本病机。中药独活（AngelicaePubescentisRadix）为伞形科植物重齿毛当归的干燥根，主产于四川、湖北等地。始载于《神农本草经》，被列为上品，具有祛风除湿、通痹止痛、益精填髓的功效，味辛、苦，微温，归肾、膀胱经。独活主要成分为香豆素类化合物，现代药理学表明其具有广泛的药理作用，比如抗炎、抗凋亡、抗氧化等作用。临床上常用以独活为主要药物的独活寄生汤治疗骨质疏松[5-7]患者，并取得了良好的效果，但是独活单味中药治疗骨质疏松症的研究，未见报道。
经典的Wnt/β-catenin信号通路在成骨细胞介导的骨形成过程中发挥至关重要的作用。绝经后骨质疏松的发生与Wnt/β-catenin信号通路关键分子GSK-3β及β-catenin等蛋白的表达密切相关，GSK-3β及β-catenin等蛋白的异常表达将导致成骨细胞[8,9]数量减少、凋亡增加并造成骨形成障碍。
本研究为了评价独活对去卵巢所致骨质疏松大鼠的治疗作用及与Wnt/β-catenin信号通路的关系，建立去卵巢骨质疏松大鼠模型，观察独活对大鼠骨密度、骨转换生化指标、骨重建蛋白及Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达的影响，为骨质疏松症的临床治疗提供理论依据。
▲摘自《解剖科学进展》期刊年
第25卷第5期
1材料与方法
1.1实验动物与分组
SPF级SD大鼠50只，雌性，体重~g，购于辽宁长生生物有限公司[SCXK（辽）：-]，动物分笼饲养，自由进食和饮水，室温维持在20~25℃，每日光照12h。在适应性饲养1周后用于实验。随机分为假手术组（Sham组）、模型组（M组）、独活低剂量组（L组，0.9g/kg）、独活高剂量组（H组，1.8g/kg）、阳性药组（Y组，mg/kg依普*酮），每组10只大鼠。
1.2药材提取及治疗
取g独活，用10倍量95%乙醇回流提取3次，每次2h，合并滤液，减压回收溶剂，得浸膏，浸膏用水溶解至终浓度为1g/ml（生药浓度），于术后30d后，对大鼠进行灌胃给药，阳性药组给予mg/kg依普*酮灌胃给药，假手术组给予等体积的生理盐水，连续治疗60d。
1.3大鼠骨质疏松模型的制作
利用双侧卵巢切除法制备大鼠骨质疏松模型[10,11]，经10%水合氯醛腹腔注射麻醉后将大鼠固定，皮肤消毒，在侧腰部开口，切口大约1cm长，打开腹腔，找到卵巢，先以消毒手术丝线结扎卵巢下输卵管，随后切除卵巢。缝合并消毒。同法摘除另一侧卵巢，待双侧卵巢完全摘除后，将其置于提前备好的干净大鼠鼠笼里，注意室温维持在25℃以上。假手术组仅切除卵巢旁与卵巢等大的一块脂肪组织，各组于最后一次给药1h后取血及处死大鼠取骨组织。
1.4股骨密度及骨灰重/干重测定
取左侧股骨利用骨密度测定仪检测骨密度，测定骨密度后将股骨置于烘箱中80℃干燥24h，精密称定重量为干重；再将其置于马氏炉内℃煅烧8h，待其冷却后，精密称定重量为灰重，计算灰重/干重百分比=灰重/干重×%。1.5大鼠血清OC、ALP、TRAP、钙、无机磷检测最后一次给药1h后，大鼠眼眶采血，rpm离心10min后取上清，-20℃保存备用。严格按照试剂盒说明书进行操作，测定大鼠血清中OC、ALP、TRAP、钙、无机磷水平。
1.6大鼠骨组织OPG、RANKL蛋白表达检测
取4%多聚甲醛中固定的右侧股骨组织，脱水、透明、石蜡包埋随后切片，厚度在5μm左右，石蜡切片在室温下稍微干燥后，置40℃恒温烤箱中烤干使用。切片用二甲苯脱蜡，梯度乙醇溶液水化，蒸馏水冲洗，高压热修复抗原，HO孵育灭内源性氧22化酶，蒸馏水洗，加入兔抗OPG、RANKL抗体（1:），4℃孵育过夜。次日，蒸馏水洗，滴加HRP标记驴抗兔二抗（1:），室温孵育1h，蒸馏水洗，滴加DAB显色30min，苏木素染液复染，在梯度酒精中浸泡脱水，切片晾干，中性树胶封片。每组大鼠选取6张切片标本，光镜下观察各组大鼠骨组织OPG、RANKL蛋白表达情况，图片采用Image-proplus6.0软件进行定量分析。
1.7Westernblot检测
利用Westernblot检测大鼠股骨组织β-catenin、p-β-catenin、GSK-3β及p-GSK-3β蛋白表达情况。蛋白提取试剂盒进行蛋白提取，使用BCA蛋白定量试剂盒对蛋白进行定量分析，变性蛋白，随后进行SDS-PAGE电泳、转膜、抗体孵育及显色，凝胶成像分析系统扫描，测定光密度。β-catenin、p-β-catenin、GSK-3β、p-GSK-3β及β-actin抗体稀释浓度分别为1:、1:、1:、1:及1:0，HRP标记二抗稀释浓度为1:0。采用目的条带与内参蛋白条带光密度比值作为结果进行统计分析。
1.8统计学分析
数据采用SPSS19.0软件进行分析处理。数据表示为均数±标准差（x±s），多组间比较采用单因素方差分析，两两组间比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。
▲摘自《解剖科学进展》期刊年
第25卷第5期
2结果
2.1独活对骨密度及骨灰重/干重的影响
骨质疏松大鼠治疗60d后，模型组大鼠股骨骨密度和骨灰重/干重百分比明显降低，差异具有显著性（P0.05，P0.01），说明去卵巢大鼠骨量严重丢失；独活高剂量组及阳性药组能够明显增加骨质疏松大鼠骨密度及骨灰重/干重百分比，差异具有统计学意义（P0.05），而独活低剂量组对大鼠骨密度及骨灰重/干重百分比的影响不明显（P0.05，图1）。
2.2独活对大鼠血清OC、ALP、TRAP、钙、无机磷的影响
模型组大鼠血清中OC、ALP及TRAP含量明显升高（P0.05,P0.01），血清中Ca水平明显降低（P0.05）；独活高剂量组及阳性药组能够降低大鼠血清中OC、ALP及TRAP含量，同时增加血清中Ca水平，与模型组相比，差异具有统计学意义（P0.05,P0.01）；而独活低剂量组与模型组相比，上述生化指标表达差异不具有显著性（P0.05）；各组之间大鼠无机磷的表达无差别，说明高剂量独活能够抑制骨质疏松大鼠骨代谢，有助于维持骨量（图2）。
2.3独活对大鼠骨组织OPG、RANKL蛋白表达的影响
骨质疏松大鼠经60d药物治疗后，对骨组织中OPG、RANKL蛋白的表达情况进行分析，结果模型组大鼠骨组织中OPG蛋白表达明显降低，RANKL蛋白表达显著升高，差异具有显著性（P0.01）；独活高剂量及阳性药组能够明显升高OPG蛋白的表达，并且抑制RANKL蛋白的表达，与模型组相比差异具有显著性，说明高剂量独活能调节骨重建，促进破骨细胞的凋亡（P0.05,图3）。
2.4独活对Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的影响
利用Westernblot法检测独活对Wnt/β-catenin相关蛋白表达的影响。结果模型组GSK-3β和p-β-catenin蛋白表达量升高，而p-GSK-3β和β-catenin蛋白表达量降低，差别具有显著性（P＜0.05，P＜0.01），与模型组相比，独活高剂量及阳性药能够抑制大鼠骨组织中GSK-3β和p-β-catenin蛋白表达量的升高，并抑制p-GSK-3β和β-catenin蛋白表达量的降低，差别具有统计学意义（P＜0.05），但独活低剂量组与模型组相比，没有显著性差别（P＞0.05，图4），高剂量独活对去卵巢导致的骨质疏松大鼠的治疗作用可能与激活Wnt/β-catenin信号通路促进骨形成有关。
3讨论
本实验通过去卵巢建立骨质疏松大鼠模型，灌胃给药60d后通过观察大鼠骨密度、骨灰重/干重、骨转换指标、骨重建蛋白及GSK-3β和β-catenin蛋白表达情况，系统分析中药独活对骨质疏松症大鼠的治疗作用及其作用机制。依普*酮为促进骨形成的临床常用药物，具有促进骨细胞增殖、降低骨吸收及雌激素样作用，从而增加骨量，所以本文选取[11]依普*酮为阳性对照药物。
骨密度是评价骨质疏松症形成和治疗效果的重要指标之一，实验结果显示，雌性大鼠摘除卵巢后，骨密度、骨灰重/干重百分比及血清中钙含量明显降低，说明模型制备成功。给予高剂量独活（1.8g/kg）60d后，骨密度、骨灰重/干重百分比含钙量，与模型组相比显著升高，说明独活能够增加骨质疏松大鼠的骨量。
▲摘自《解剖科学进展》期刊年
第25卷第5期
正常成年人成骨细胞的骨形成及破骨细胞的骨吸收是处于动态平衡的，在病理状态下，相对于骨吸收的骨形成明显不足，导致骨量流失，从而形成[12]骨质疏松。OC是研究骨代谢的一项生化指标，它主要由成骨细胞合成，在调节骨代谢方面具有重要的作用；ALP是碱性环境中水解磷酸酯的一种酶类，是成骨细胞的标志酶，常用来评价骨形成及骨转换。正常条件下，ALP处于低水平，而ALP表达升高则说明骨骼处于不正常状态，比如骨质疏松；TRAP是评价破骨细胞活性记、忆骨吸收的标志物，女性绝经后，卵巢功能衰退，雌激素分泌减少，导致骨重建平衡打破，骨吸收增加，骨形成被抑制，[13]TRAP水平显著升高。
本研究结果显示，摘除卵巢后，大鼠血清中OC、ALP及TRAP含量明显升高，说明骨代谢活跃、骨转换增强、骨吸收增加，而骨形成被抑制，所以导致了骨质疏松的发生，而经过高剂量独活60d的治疗，大鼠血清中OC、ALP及TRAP含量明显降低，说明高剂量独活能够抑制骨代谢、降低骨吸收，促进骨形成，发挥治疗作用。
OPG及RANKL在调节骨代谢方面具有重要的作用，在骨质疏松症的形成及发展中发挥着重要的作用。OPG是一种分泌性可溶性的蛋白，具有增加骨密度，抑制破骨细胞分化和骨吸收活性；RANKL是维持破骨细胞功能的关键蛋白，RANKL与其受体结合可抑制破骨细胞形成、分化、成熟和凋亡，从而使骨吸收增加，骨量减少；当OPG与RANKL结合后，对其受体形成阻断性竞争，能够促进破骨细胞[14]形成、分化、成熟和凋亡。实验结果显示，与模型组大鼠相比，独活高剂量组能够明显增加OPG蛋白表达，抑制RANKL蛋白表达，进一步说明独活能够促进骨形成及破骨细胞成熟和凋亡。
▲摘自《解剖科学进展》期刊年
第25卷第5期
Wnt/β-catenin信号通路在骨形成及骨代谢方面起着重要的作用，β-catenin是骨形成的关键调节因子，β-catenin的降解可导致血清中ALP活性增加，促进骨代谢，降低骨密度，导致骨质疏松的发生[15]。GSK-3β是β-catenin上游基因，能调控β-catenin表达，当GSK-3β活性增强时，β-catenin活性减弱，Wnt/β-catenin信号通路被抑制，所以激活Wnt/β-catenin信号通路能使GSK-3β活性减弱，β-catenin活性增加，促进骨形成、抑制骨代谢，增加骨密度。本实验结果显示，经过高剂量独活治疗后，骨质疏松症大鼠骨组织中GSK-3β和p-β-catenin蛋白表达量降低，且p-GSK-3β和β-catenin蛋白表达量升高，说明独活促进骨形成治疗骨质疏松症与激活Wnt/β-catenin信号通路有关。
综上所述，本研究表明，独活通过增强成骨细胞的骨形成及抑制破骨细胞的骨吸收、骨代谢，从而增加骨密度，治疗骨质疏松症，这可能在一定程度上与激活Wnt/β-catenin信号通路有关。
*文章转自：《解剖科学进展》期刊年第25卷第5期（中药独活激活Wnt/β-catenin信号通路对骨质疏松大鼠的作用）。
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